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過栄養によるβ細胞のストレスとデトックス経路

糖毒性Glucotoxicity、糖脂質毒性 Glucolipotoxicity によるβ細胞のストレス
・小胞体、ミトコンドリア、酸化ストレス
高次構造異常のあるタンパク質が蓄積した際に、異常タンパク質を修復するための小胞体シャペロンが転写誘導される。この応答はUnfolded Protein Response (UPR)もしくは小胞体ストレス応答ER Stress Responseと呼ばれている。
インスリン生合成の維持にはUPRが必要である。β細胞で高血糖に暴露されたのちUPRをになうTxnip、Myc、Chopは上昇する。UPR component であるAtf6の抑制は、高血糖によるインスリン遺伝子発現の抑制を予防する。β細胞にはantioxidant enzyme の発現が少ないため reactive oxygen species を捕捉するキャパシティが低い。グルコース上昇単独あるいはグルコースと遊離脂肪酸(FFA)の上昇では、ミトコンドリアの分裂と融合を変化させ、エネルギー代謝に影響し、β細胞のアポトーシスに関与する。

・Dedifferentiation
β細胞特有の遺伝子発現の低下 (MafA、PDX1、NeuroD1、NKX6.1、Glut2、glucokinase)があり、本来、β細胞に発現しない lactate dehydrogenase 、glucose-6-phosphatase、hexokinase が発現する。

・ミトコンドリア電位依存性陰イオンチャネルの細胞膜上の発現増加
ミトコンドリア外膜の電位依存性陰イオンチャネル (voltage-dependent anion channel-1 (VDAC1))の発現は、非糖尿病者でA1C値と相関する。高血糖下では、VDAC1の細胞膜/細胞質比が上昇し、細胞膜上の発現が増加する。その結果ATPを損失し2型糖尿病患者の膵島β細胞の機能低下の原因となる。

アミノ酸による過栄養によるストレス
1969年Fleig らは、分枝鎖アミノ酸(BCAA)と肥満、インスリン抵抗性との関連を指摘している。分枝鎖アミノ酸、芳香族アミノ酸は、mTORを活性化し、肥満、インスリン抵抗性、その結果としての2型糖尿病の発症率と関連している。肥満者で上昇しているBCAAがβ細胞分子機能やインスリン感受性に変化を与え糖尿病発症を誘発している可能性があるがそのメカニズムは不明である。

グルタミンは代謝産物を経由してインスリン分泌を促進する。またグルタミンはIGF2/IGF1受容体シグナリングを介してβ細胞の増殖を促進すると。グリシンは中枢性、末梢性のメカニズムでグルコースによるインスリン分泌やグルコースホメオスタシスを促進する。

高タンパク食による血漿中アミノ酸上昇は、β細胞の機能やGLP-1分泌を改善する。これまでの報告で、アミノ酸上昇はインスリン分泌増強という点で肥満者のβ細胞機能には全般的に良い影響を与えている。

これらの一部は軽度の栄養ストレスに対する適応過程かもしれないがβ細胞の疲弊(β-cell exhaustion) に関与するかもしれない。慢性的にさまざまなアミノ酸が上昇することが、高血糖や高脂血症と相乗的に作用してβ細胞にnegative impact を与えるかどうかさらに検討する必要がある。

デトックス経路
・Glycerolipid/FFA cycle
Glycerolipid/FFA cycleは、ATPを消費するため、インスリン分泌に対するfuel signaling として作用するだけでなくfuel-excess detoxication の役割も果たしている。

・グリセロールの排出
哺乳類ではじめてグリセロール3リン酸(Gro3P)をグリセロールへ加水分解する酵素Gro3Pフォスファターゼ (Gro3PP)が見出された。グリセロールは細胞外へ排出される。Gro3PPのノックダウンはin vitroで糖毒性を悪化させる。Gro3PPの過剰発現はグルコースと過剰なFFAによるアポトーシスへのtoxic effect を軽減する。

・脂肪酸酸化
Carnitine palmitoyl transferase 1 (CPT1) は脂肪酸酸化の律速段階となる酵素で、CPT1の抑制はβ細胞のlipotoxicity を悪化させる。PPARαシグナリングも脂肪酸酸化に重要で、高グルコース濃度ではPPARα発現が低下する。

・FFA の放出
高血糖下でβ細胞はグリセロールだけでなくFFAも放出している。

・中性脂肪、コレステロール、コレステロールエステル、グリコーゲンの形成
解糖系に入った炭素の15%、10%、5%がそれぞれ中性脂肪、コレステロールエステル、グリコーゲンに変換される。コレステロールの放出はデトックス経路の一部であると考えられる。

・無益回路(Futile cycle) とミトコンドリア脱共役
解糖系ではグルコースかビルビル酸へGluconeogenesisではピルビン酸がグルコースとなりATPが消費される。ミトコンドリア脱共役では熱産生thermogenesis が生じる。FFAは β細胞で急速に脱共役タンパク(uncoupling protein)2を誘導する。UCP-2のuncoupling protein としての役割については議論が分かれている。

・クエン酸やクレブス回路の中間代謝産物の放出
INS-1細胞では解糖系に入った炭素の20%がクエン酸として放出されている。

Prentki M et al. Nutrient-Induced Metabolic Stress, Adaptation, Detoxification, and Toxicity in the Pancreatic β-Cell. Diabetes. 2020 Mar;69(3):279-290.

UPR研究がガードナー賞を獲得するまでの経緯 京都大学大学院 森研究室

Preserving Insulin Secretion in Diabetes by Inhibiting VDAC1 Overexpression and Surface Translocation in β Cells. Cell Metab. 2019 Jan 8;29(1):64-77.e6.

Mugabo Y et al. Identification of a mammalian glycerol- 3-phosphate phosphatase: role in metabolism and signaling in pancreatic β-cells and hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 2016;113:E430–E439

in vivo で確認されたβ細胞のリーダー細胞 Leader Cell

グルコース刺激によるCa oscillationにはペースメーカーとなるリーダー細胞 Leader Cellが存在する。

zebrafishで、超高感度プローブ(GCaMP6)を用いてβ細胞のCa oscillationをin vivo で可視化した。zebrafish larvae の膵島のβ細胞は平均30個で、Ucn3 など成熟β細胞のマーカーを有している。

グルコース刺激によるCa oscillationには、リーダー細胞があり、周辺細胞 (follower)との連結 connectivityが、グルコース注入前 10~15%で、グルコース注入後に~50%へ増加する。

two-photon laser irradiation によりリーダー細胞の除去した結果、グルコース刺激による膵島のCa oscillation が認められなくなる。

マウスの前眼房に移植したマウスの膵島でも、in vivoでβ -cell connectivity が認められグルコース刺激によりβ cell connectivityは増加する。

zebrafishのリーダー細胞は、マウスのin vitro の実験で定義されたハブ細胞 Hub cellを思い起こさせる。ハブ細胞は、免疫染色でグルコキナーゼの発現が多く、インスリン、PDX-1、Nkx6.1の発現が少ない。
zebrafish β細胞の遺伝子解析の結果、グルコキナーゼの発現が多くインスリンの発現が低い細胞の割合はβ細胞の9%、マウスではβ細胞の11%であった。zebrafishのグルコキナーゼ抗体がないため免疫染色はおこなえなかった。

Salem S et al. Leader β-cells coordinate Ca2+ dynamics across pancreatic islets in vivo. Nature Metabolism volume 1, pages615–629 (2019)


Johnston NR et al. Beta Cell Hubs Dictate Pancreatic Islet Responses to Glucose Cell Metab. 2016 Sep 13;24(3):389


パルス状のインスリン分泌

インスリンは、約5分間隔でパルス状に分泌されている。
β細胞の膜電位は、1分未満間隔のfast oscillation 、4-6分間隔のSlow oscillation および compound oscillationがある。Slow oscillation とcompound oscillation は、血中インスリンの oscillation と一致する。1)

β細胞の膜電位、細胞内カルシウム濃度、解糖系酵素活性、cAMP、ミトコンドリア膜電位、β細胞や膵島の酸素消費量、NAD(P)H、ATP/ADP、KATP-current は、 slow oscillation を示す。1, 2, 3)

インスリンのバルス状分泌を制御するのは、Ca2+依存性ATP産生やCa2+ pump によるATP消費の結果が metabolic oscillation である、あるいは解糖系の oscillation がATP産生のoscillation を生じさせ、KATP channel を調節することにより、electrical bursting と Ca2+ oscillation を制御するという説である。
現在は、解糖系に対するCa2+のフィードバックを取り入れたIntegrated oscillation model が妥当であるとされている。1)
そのほか cAMP oscillation、膵島のパラクラインファクター、インスリンそのものも β-cell oscillation に関与する。1)

<Ca2+ と代謝シグナルの相互作用>
Ca2+ oscillation とmetabolic oscillation は相互に影響している。1)
Ca2+濃度上昇時、Ca2+ ATPase pumpの加水分解によりATP濃度は緩やかに減少し、KATP channel は再活性化される。Ca2+濃度低下時、ATPは緩やかに上昇、KATP channel が抑制され、あらたなactive phase が開始される。

Phosphofructokinase (PFK) は、fructose-6-phosphate をfructose-1,6- bisphosphate (FBP)に変換する。PFKはATP によりアロステリックな阻害を受ける。グルコース10mMの存在下の膵島で、FBP濃度はノコギリの歯状に変動する。ダイアゾキサイドにより変動は消失するが、KCl による膜の脱分極でカルシウムを安定させた結果、ノコギリの歯状の変動が回復する。このことは Metabolic oscillationが Ca2+ oscillationを必要とすることを意味している。

ピルビン酸デヒドロゲナーゼはピルビン酸をacetyl-CoAに変換する酵素で Ca2+により強力に活性化される。acetyl-CoAがミトコンドリアで代謝され ATPが上昇、PFKが抑制され解糖系の速度が低下する。

α-ketoisocaproic acid (KIC)はロイシンの代謝産物で解糖系を経由せずクエン酸回路に入る。グルコースのない条件下で、KICはCa2+ oscillation を惹起する。

パルス状のインスリン分泌の利点 3)
下流のシグナリングの複雑さに対応する。
細胞間のネットワークをコーディネートする。
間欠性のサイクルが細胞のストレスを軽減する。

イヌ、ラットでパルス状のインスリン分泌がインスリン受容体シグナルを増強 potentate し、肝糖産生抑制に有効である。3)

1. Bertram R, Satin LS, Sherman AS. Closing in on the Mechanisms of Pulsatile Insulin Secretion. Diabetes. 2018 Mar;67(3):351-359.

2. Nunemaker CS, Satin LS. Episodic hormone secretion: a comparison of the basis of pulsatile secretion of insulin and GnRH. Endocrine. 2014 Sep;47(1):49-63.

3. Tian G, Sandler S, Gylfe E, Tengholm A. Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in α- and β-cells within intact pancreaticislets. Diabetes. 2011 May;60(5):1535-43.

4. Bertram R, Sherman A, Satin LS. Metabolic and electrical oscillations: partners in controlling pulsatile insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab 2007;293: E890–E900

5. Matveyenko AV et al. Pulsatile portal vein insulin delivery enhances hepatic insulin action and signaling. Diabetes. 2012 Sep;61(9):2269-79.

cAMP oscillationのまとめ(1)

インスリンはパルス状に門脈に分泌され、肝臓のインスリンシグナルに関係する遺伝子発現を制御している。


アラキドン酸の代謝産物 20-HETEは、autocrine および paracrine によりFFR1 (GPR40) を活性化する。

GPR40は、ライガンドの刺激によりPhospholypase C (PLC) を活性化する。PLC は、Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) を diacylglycerol (DAG) と inositol trisphosphate (IP3) に加水分解する。
IP3の増加は、ER からカルシウム誘導のトリガーとなり、インスリン小胞の開口放出が促進される。
DAG/PKC、PKD 経路もインスリン開口放出に関与する。1)

GPR40 のライガンドをスクリーニングした結果、20-hydroxyeicosatetraenoic acid (20-HETE)が見出された。FFAR1を強発現させたCOS-1細胞で、20HETE はパルミチン酸、リノール酸、α-linoleic acid よりも細胞内カルシウム濃度を増加させる。

β細胞では、グルコース濃度依存性に20-HETE が産生される。
グルコース刺激によりβ細胞内のカルシウム濃度が上昇、phospholipase A2 が活性化されリン脂質からアラキドン酸が合成される。cytochrome P450-dependent ω-hydroxylase によりアラキドン酸が 20-HETEに変換される。(論文内に図があります。)
β細胞で、20-HETE は autocrine、paracrine により GPR40を介してインスリン分泌を増強する。2)

1. Prentki M, Matschinsky F M, Madiraju SR, Metabolic signaling in fuel- induced insulin secretion. Cell Metab. 18, 162-185 (2013).
脂肪酸がインスリン分泌を増強する機構はこちら

2. Tunaru S et al. 20-HETE promotes glucose-stimulated insulin secretion in an autocrine manner through FFAR1. Nat Commun. 2018 Jan 12;9(1):177.
 

ハブとなるβ細胞

グルコースに対する膵島の反応は、1-10%のβ細胞が、ハブとなりペースメーカーの役割を果たしている。
gap junction 阻害薬処置で、ハブ細胞の検出数は低下する。

ハブ細胞は、未分化と成熟の両面をもつ
他の細胞に比べ、インスリン含量、PDX-1、Nkx6.1の発現は低下している。Ngn3 の発現は認めず、グルカゴンとは共染色しない。
グルコキナーゼの発現は増加している。ミトコンドリアタンパク Tomm20は他の細胞と同等の発現。
グルコキナーゼ発現が増加しているため、周囲の細胞に比べ、グルコース上昇に対し敏感であるかもしれない。

糖尿病に類似した サイトカインによる proinflammatory な環境や、gluco(lipo)toxicity な環境でハブ細胞数は短期間に減少する。
gap junction マーカーconnexin-36の発現も低下する。

ハブ細胞の電気的興奮の伝播には、gap junctionに加え、膵島内の自律神経も関与している。

Johnston NR et al. Beta Cell Hubs Dictate Pancreatic Islet Responses to Glucose Cell Metab. 2016 Jul 21. pii: S1550-4131(16)30306-0. doi: 10.1016/j.cmet.2016.06.020. [Epub ahead of print]

p16はミトコンドリア生合成を増加させ、インスリン分泌を増強する

 p16はcyclin D、cyclin dependent kinase を抑制し、CDKN2A locus にコードされる。
CDKN2A のgenetic polymorphism は2型糖尿病との関連が指摘されている。

膵島におけるp16の発現は年齢とともに増加する。

β細胞にp16を発現させたマウスでは、膵島が大きく、グルコース刺激によるインスリン分泌とインスリン含有量が多い。

p16を強発現させたβ細胞で、ミトコンドリア数が増加、Peroxisome proliferative-activated receptor gamma coactivator 1 α (PGC1α) の発現量が増加している。PGC1α は、ミトコンドリアの生合成の master transcription factor として知られている。

p16によるインスリン分泌増加、ミトコンドリア活性化には、mechanistic target of rapamycin (mTOR)、Peroxisome proliferative-activated receptor(PPAR)-γが関与している。

Herman A et al. p16(Ink4a)-induced senescence of pancreatic beta cells enhances insulin secretion. Nat Med. 2016 Apr;22(4):412-20.

β細胞の代謝シグナル(4)

 モノアシルグリセロール (MAG)を加水分解するABHD6 の発現を抑制したマウスでは、高脂肪食で肥満が起こらない。摂餌量が低下、エネルギー消費量が増加する。
MAGの上昇は、PPARα、PPARγを活性化し、褐色脂肪細胞を増加させる。
摂餌量が低下した原因は明らかでない。

Zhao S. et al. α/β-Hydrolase Domain 6 Deletion Induces Adipose Browning and Prevents Obesity and Type 2 Diabetes. Cell Rep. 2016 Mar 29;14(12):2872-88.

アンドロゲン受容体シグナルは、インスリン分泌を増強する。

テストステロン欠乏は肥満にかかわらず血糖値が上昇しやすい。
抗アンドロゲン治療を行う前立腺がん患者では2型糖尿病を発症しやすい。

ヒトの男性、オスのマウスの膵島で、アンドロゲン受容体はインスリンと共存し、大部分は核外に存在する。
テストステロンは、核外のアンドロゲン受容体を介して、cAMP 依存性にグルコース刺激インスリン分泌を増強する。

アンドロゲン受容体の活性化は、GLP-1によるグルコース刺激インスリン分泌を増強する。

Navarro G. et al. Extranuclear Actions of the Androgen Receptor Enhance Glucose-Stimulated Insulin Secretion in the Male. Cell Metab. 2016 Apr 26. pii: S1550-4131(16)30118-8.
膵β細胞特異的にアンドロゲン受容体(AR) を欠損させたオスのマウスでは、Dihydrotestosterone によるグルコース刺激下のインスリン分泌増強作用が認められない。

Wortham M, Sander M. High T Gives β Cells a Boost Cell Metab. 2016 May 10;23(5):761-3.

Keating NL, O'Malley A, Freedland SJ, Smith MR. Diabetes and cardiovascular disease during androgen deprivation therapy: observational study of veterans with prostate cancer. J Natl Cancer Inst. 2012 Oct 3;104(19):1518-23.


β細胞の代謝シグナル(3)

 β細胞でグルコース、FFA、アミノ酸が代謝される。

グルコースの代謝産物 Glycerol-3-phosphate は、Glycerol/FFA cycle へも合流する。
(グルコース→glucose-6-phosphate → dihydroxyacetone phosphate → Glycerol-3-phosphate →Glycerol/FFA cycle)
Glycerol/FFA cycleから生じるモノアシルグリセロール (MAG) は、グルコース刺激インスリン分泌を増強する。MAGは、Munc-18に結合し、インスリンの exocytosisを促進する。

グルタミンは、グルタミナーゼによりグルタミン酸となる。
グルタミン酸は、ミトコンドリアマトリックスで、glutamate dehydrogenase (GDH) により代謝され、α-ケトグルタル酸となりTCA cycle に入る。GDH の gain-of-function mutation は、hyperinsulinemic hypoglycemic syndrome の原因となる。この疾患ではタンパク質の多い食事で低血糖が誘発される。
ロイシンは、GDHを活性化する 。

Prentki M, Matschinsky FM, Madiraju SR. Metabolic signaling in fuel-induced insulin secretion. Cell Metab. 2013 Aug 6;18(2):162-85. doi: 10.1016/j.cmet.2013.05.018. Epub 2013 Jun 20.

Zhao S. et al. α/β-Hydrolase domain-6-accessible monoacylglycerol controls glucose-stimulated insulin secretion. Cell Metab. 2014 Jun 3;19(6):993-1007. doi: 10.1016/j.cmet.2014.04.003. Epub 2014 May 8.

膵島の first responders とlow responders

 グルコース刺激に対して膵島が均一にインスリンを分泌するわけではない
一部の膵島が、貯蔵されているインスリンの大部分を放出する (first responders)。これまで in vitroでは観察されていなかった現象。他の膵島が全くインスリンを分泌していない noponders か、ごく少量のインスリンを分泌している low responders であるのかは確定していない。

まとめ
ヒトプロインスリン遺伝子発現を蛍光化したマウスで、膵臓の表面から、Photometrics Coolsnap EZ digital camera (Roper) を用いて、膵島のインスリン分泌を観察した。胃にグルコースを注入し血糖値>280 mg/dl となった時、20%未満の細胞で、50%を超えて蛍光強度が低下する。蛍光強度が1%より少ない変化は検知できない。蛍光強度を検知できない膵島が少量のインスリンを分泌している可能性は否定できていない。
少量のインスリンを分泌する膵島 low responders が多数あれば、first responders よりも血中のインスリン値上昇に貢献している可能性がある。
麻酔下で観察は、血圧や膵島に対する中枢性神経制御に影響している可能性もある。

Zhu S et al. Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet β-Cells In Vitro and In Vivo Diabetes. 2016 Mar;65(3):699-709. doi: 10.2337/db15-1264. Epub 2015 Dec 8.

Rizzo MA, Emptying the Pool: Modular Insulin Secretion From the Pancreas Diabetes. 2016 Mar;65(3):542-4. doi: 10.2337/dbi15-0041.


プロフィール

N. Ishizuka

Author:N. Ishizuka
糖尿病専門医です。インスリン分泌の基礎研究を経て臨床に戻りました。これまで読んだ論文を臨床に生かしていこうと思い、ブログ形式でまとめています。

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